圖a. RNAiMAX轉(zhuǎn)染NC-FAM到Hela細(xì)胞，24h.	圖b. Starvio轉(zhuǎn)染NC-FAM到Hela細(xì)胞，24h.

早期，研究者在做siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，市面上還沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染的試劑產(chǎn)品，因此，常常只能選擇lipofectamine2000、lipofectamine3000等主要針對(duì)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的試劑來(lái)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，這些轉(zhuǎn)染試劑確實(shí)能對(duì)部分細(xì)胞進(jìn)行有效的siRNA轉(zhuǎn)染，但在很多細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染效果上，卻表現(xiàn)平平，并且細(xì)胞毒性很大，這就是為人熟知的第一代siRNA轉(zhuǎn)染試劑。隨著RNAi技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越多和siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的廣泛開(kāi)展，第二代新型siRNA轉(zhuǎn)染試劑隨之問(wèn)世，其主要代表產(chǎn)品為lipofectamine RANiMAX和Starvio siRNA轉(zhuǎn)染試劑。

相較于第一代siRNA轉(zhuǎn)染試劑，第二代產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)明顯，尤其是在siRNA轉(zhuǎn)染的效率上有了非常顯著的提升，并且試劑成分更加溫和，細(xì)胞毒性更低，非常適合于siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。接下來(lái)我們就從以下幾方面來(lái)深度剖析一下兩代試劑的差別：

一、從質(zhì)粒和siRNA的結(jié)構(gòu)以及作用機(jī)制上分析質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染試劑的不通用性

以lipofectamine2000、lipofectamine3000為代表的第一代siRNA轉(zhuǎn)染試劑，其實(shí)主要為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA而研發(fā)。我們都知道，質(zhì)粒DNA和siRNA在結(jié)構(gòu)上就相差甚遠(yuǎn)，就大小而言，質(zhì)粒一般可達(dá)數(shù)千堿基對(duì)，而siRNA通常只有21個(gè)堿基對(duì)。并且，從結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性上來(lái)說(shuō)，質(zhì)粒DNA較為穩(wěn)定，而siRNA作為核糖核苷酸比脫氧核糖核苷酸更容易被降解，極不穩(wěn)定。所以，質(zhì)粒和siRNA本就是兩種大相徑庭的物質(zhì)。除了這些結(jié)構(gòu)上的差異，兩者的作用機(jī)制也存在巨大區(qū)別，質(zhì)粒DNA作用在細(xì)胞核，目的是使基因過(guò)表達(dá)，而siRNA作用于細(xì)胞質(zhì)，目的是敲降或干擾某個(gè)目的基因的表達(dá)。因此，綜上兩方面原因，DNA和siRNA的轉(zhuǎn)染試劑并不通用，盡管這些一代轉(zhuǎn)染試劑可以在一定程度上進(jìn)行siRNA的轉(zhuǎn)染，甚至是實(shí)現(xiàn)siRNA和DNA的共轉(zhuǎn)染，但是對(duì)于單獨(dú)siRNA的轉(zhuǎn)染效果并不理想。而lipofectamine RANiMAX和Starvio等二代試劑針對(duì)性更強(qiáng)，在siRNA轉(zhuǎn)染上做到了真正意義上的專(zhuān)業(yè)，不僅為siRNA轉(zhuǎn)染降低了試劑的毒性，并且顯著提高了siRNA轉(zhuǎn)染的效率。

二、從成分和毒性上分析為何第二代siRNA轉(zhuǎn)染試劑更適合siRNA轉(zhuǎn)染

siRNA轉(zhuǎn)染比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性要求更為嚴(yán)格，主要是由于轉(zhuǎn)染試劑的毒性往往是造成眾多基因的表達(dá)水平直接或間接下調(diào)的原因，這對(duì)于一些過(guò)量表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，影響不大，但在以研究基因干擾為主要目的的RNAi實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，就是致命的，因?yàn)榧?xì)胞死亡和RNAi實(shí)驗(yàn)造成的結(jié)果在現(xiàn)象上是一致的，輕則影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，重則改變實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，siRNA實(shí)驗(yàn)首先要求選擇適合小核酸的高效轉(zhuǎn)染試劑，其次要求轉(zhuǎn)染試劑本身的細(xì)胞毒性很小。

而第一代siRNA轉(zhuǎn)染試劑的研發(fā)材料普遍以陽(yáng)離子脂質(zhì)體或聚乙烯亞胺（PEI）為主，這兩類(lèi)成分對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)毒性是比較大的。并且由于第一代試劑更適用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，且?guī)в懈唠姾蓮?qiáng)度，這也在一定程度增加了細(xì)胞毒性，也就不難解釋為什么很多研究者反映在一些耐受能力弱的細(xì)胞中會(huì)引起細(xì)胞嚴(yán)重死亡，尤其是對(duì)于原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。

那么，第二代siRNA轉(zhuǎn)染試劑在成分和毒性上有哪些優(yōu)勢(shì)呢？隨著基因干擾技術(shù)的不斷發(fā)展，專(zhuān)門(mén)適用于siRNA轉(zhuǎn)染的試劑應(yīng)運(yùn)而生，以RANiMAX和Starvio為主的二代siRNA轉(zhuǎn)染試劑，在成分上進(jìn)行了優(yōu)化與升級(jí)，RANiMAX雖仍是陽(yáng)離子脂質(zhì)體成分，但和lipofectamine2000/3000相比，對(duì)細(xì)胞的作用溫和了很多，細(xì)胞死亡率大概只有10%，是專(zhuān)門(mén)為siRNA轉(zhuǎn)染設(shè)計(jì)研發(fā)的；而Starvio的成分為新型的可降解生物納米材料，研發(fā)者在研發(fā)時(shí)就從源頭極大限度的降低了試劑的毒性，并且這種成分能夠在進(jìn)入細(xì)胞后自身很快進(jìn)行代謝降解，來(lái)確保siRNA得到充分釋放，其毒性之低甚至可用于siRNA藥物研發(fā)。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)，空白組（即正常培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)照組）和用Starvio進(jìn)行轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞死亡率幾乎一致，也就是說(shuō)Starvio對(duì)細(xì)胞的毒性更低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其細(xì)胞毒性，我們?cè)谠笫笾鲃?dòng)脈平滑肌細(xì)胞上進(jìn)行了小核酸NC-FAM的轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Starvio幾乎沒(méi)有引起細(xì)胞死亡，對(duì)小核酸NC-FAM的轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率在該細(xì)胞中可達(dá)90%以上，這是一代試劑所無(wú)法達(dá)到的siRNA轉(zhuǎn)染效果。

圖1. Starvio轉(zhuǎn)染NC-FAM到原代大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)中，24h，明場(chǎng)圖。	圖2. Starvio轉(zhuǎn)染NC-FAM到原代大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)中，24h，熒光圖。

三、從轉(zhuǎn)染效率上分析兩代siRNA轉(zhuǎn)染試劑的性能差異

一代試劑在研發(fā)最初是為了更好的包裹分子量較大的質(zhì)粒DNA，所以運(yùn)用了極高的電荷強(qiáng)度將DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。確實(shí)，一些案例和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，這種高電荷強(qiáng)度的試劑在一定程度上能夠進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，但往往轉(zhuǎn)染效果無(wú)法達(dá)到最佳，原因是被轉(zhuǎn)入的siRNA無(wú)法得到完全釋放以至于不能充分發(fā)揮作用，這也就是為什么很多研究者反映明明鏡下熒光點(diǎn)很多很亮，但一做qPCR卻發(fā)現(xiàn)基因沉默效率很低的原因。

區(qū)別于第一代產(chǎn)品，第二代siRNA轉(zhuǎn)染試劑是專(zhuān)門(mén)為轉(zhuǎn)染siRNA、miRNA mimics、miRNA inhibitor等這類(lèi)小分子核酸研發(fā)的，針對(duì)性更強(qiáng)的同時(shí)，能夠使siRNA得到最大程度的轉(zhuǎn)染和胞內(nèi)釋放，以下是RNAiMAX和Starvio兩款siRNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)FAM-NC到Hela細(xì)胞的熒光圖，轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率均可達(dá)到90%以上（圖a、b）。

同時(shí)，為了進(jìn)一步對(duì)比兩代siRNA轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率，我們將兩款一代試劑和RNAiMAX、Starvio進(jìn)行了基因沉默效率的比較，在同步轉(zhuǎn)染siLamin A/C到Hela后，24h對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行細(xì)胞收集，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示RNAiMAX、Starvio兩款試劑的敲低效率最高，對(duì)Lamin A/C基因敲低效率均在90%以上（圖c），可見(jiàn)第二代siRNA轉(zhuǎn)染試劑能夠進(jìn)行高效轉(zhuǎn)染siRNA的同時(shí)，也能獲得理想的對(duì)目的基因的敲降效果。

圖c. 不同siRNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siLamin A/C到Hela細(xì)胞后，24h，Lamin A/C基因mRNA表達(dá)水平的比較。