一、定義與作用原理

脫氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I，DNase I），是一種能夠消化單鏈或雙鏈DNA的內(nèi)切核酸酶。這種酶通常來(lái)源于牛胰腺，是一種廣泛使用的分子生物學(xué)工具。其原理是DNase I能夠水解DNA的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生含有5'-磷酸基團(tuán)和3'-OH基團(tuán)的單脫氧核苷酸和寡脫氧核苷酸。其活性依賴于Ca²⁺，并可被Mg²⁺、Mn²⁺等二價(jià)金屬離子激活。在Mg²⁺存在下，DNase I隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；而在Mn²⁺存在下，它可以在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。

圖1 DNase I在Mg²⁺、Mn²⁺存在下水解雙鏈DNA的原理圖

二、RNase-free DNase I的應(yīng)用

RNase-free DNase I作為一種專為保持RNA完整性而設(shè)計(jì)的無(wú)核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶I，它在分子生物學(xué)研究中具有非常廣泛的應(yīng)用。以下是一些主要的應(yīng)用領(lǐng)域：

1、RNA提?。和ㄟ^使用DNase I處理RNA樣本，?可以有效地去除DNA，?從而獲得高質(zhì)量的RNA樣品用于分子生物學(xué)研究。

2、去除RNA樣品中的基因組DNA污染：在進(jìn)行RT-PCR或RNA測(cè)序之前，使用RNase-free DNase I處理RNA樣品，以去除可能存在的DNA污染，確保RNA數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

3、體外轉(zhuǎn)錄后去除DNA模板：在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，使用RNase-free DNase I去除剩余的DNA模板，為后續(xù)的RNA操作提供純凈的RNA樣品。

4、DNase I足跡法：基于DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合后，?該結(jié)合部位在后續(xù)的DNase I消化過程中不會(huì)被切割，?從而在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上留下“足跡”，?即顯示出未被DNase I切割的DNA片段。?這種方法能夠精確地定位蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)，是了解轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要手段。

5、缺口平移法進(jìn)行DNA標(biāo)記：利用DNA酶在DNA雙鏈上制造缺口，?并通過大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的多種酶促活性將標(biāo)記的三磷酸脫氧核糖核苷（?dNTP）?摻入新合成的DNA鏈中，?從而合成高比活性的均勻標(biāo)記的DNA探針，用于多種分子生物學(xué)研究。?

6、細(xì)胞培養(yǎng)過程中的應(yīng)用：在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，RNase-free DNase I可以作為添加物，幫助消化細(xì)胞間的粘連，促進(jìn)細(xì)胞分散。

7、TUNEL檢測(cè)中的陽(yáng)性對(duì)照：在細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測(cè)中，RNase-free DNase I可用于部分剪切基因組DNA，作為陽(yáng)性對(duì)照。

8、生產(chǎn)高質(zhì)量RNA：RNase-free DNase I在生產(chǎn)過程中的應(yīng)用，可以確保從RNA合成起始階段就維持高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提高最終產(chǎn)品的質(zhì)量和一致性。

三、RNase-free DNase I的選擇標(biāo)準(zhǔn)

1、RNase殘留少：

研究者需確保所選的DNase I產(chǎn)品是低RNase殘留的，這對(duì)于保持RNA樣品的完整性至關(guān)重要，這是因?yàn)樵谏飳?shí)驗(yàn)中，?RNase?的存在可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成負(fù)面影響。

?DNase I?主要用于降解RNA樣品中的DNA，?但在處理過程中，?如果DNase I本身含有RNase活性，?那么在去除DNA的同時(shí)，?也可能會(huì)降解樣品中的RNA，?從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，尤其是對(duì)于一些RNA豐度較低的樣本檢測(cè)，往往會(huì)導(dǎo)致相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。?因此，?選擇RNase殘留少的Dnase I是確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。目前，像國(guó)際知名品牌Thermo Fisher、Takara，國(guó)內(nèi)的Starvio等都具備充分純化的DNase I產(chǎn)品。

2、DNase I活性高

選擇高活性的DNase I在提高酶切效率方面起著非常重要的作用。?高活性的DNase I能夠在較短時(shí)間內(nèi)高效地切割DNA，有效?減少了實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間和成本，?這對(duì)于需要快速處理大量RNA樣本的實(shí)驗(yàn)尤為重要。那么，如何高效選擇高活性的DNase I呢？我們實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，不要看廠家標(biāo)稱的活性單位，要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選，實(shí)驗(yàn)方法最好選用qPCR。以此方法，我們篩選了國(guó)內(nèi)4家公司的DNase I。其中，Starvio RNase-free DNase I活性表現(xiàn)最為出色，只需0.5uL即可充分消化1ug細(xì)胞RNA中伴存的DNA，不經(jīng)RT直接qPCR檢測(cè)出的GAPDH的CT值大于40，完全符合診斷試劑的研制要求。

圖A為未使用Starvio RNase-free Dnase I處理的1ug細(xì)胞RNA樣本中GAPDH的擴(kuò)增曲線。圖B為0.5uL Starvio RNase-free Dnase I處理后的1ug細(xì)胞RNA樣本中GAPDH的擴(kuò)增曲線。